Os cardenolídeos são esteroides cardiotônicos inibidores da Na⁺/K⁺-ATPase (NKA) com potencial antitumoral demonstrado, porém sua janela terapêutica estreita limita a aplicação clínica segura desses compostos. A modificação estrutural na posição C-3 da digoxigenina representa uma estratégia racional para a obtenção de análogos com perfil farmacológico otimizado. Neste trabalho, dois derivados de digoxigenina funcionalizados em C-3 (oxima e tiossemicarbazona) foram sintetizados e tiveram sua citotoxicidade avaliada em diferentes concentrações (10, 100 e 500 nM; 1, 10 e 100 μM) por 24 horas de exposição a partir do ensaio de MTT frente a linhagem celular de câncer de colo uterino imortalizada (HeLa). A digoxigenina foi obtida por hidrólise da digoxina e oxidada seletivamente a digoxigenona, precursora comum de ambos os derivados, obtidos por condensação com hidroxilamina e tiossemicarbazida, respectivamente. Os produtos foram caracterizados por RMN de ¹H e ¹³C e espectrometria de massas (ESI-MS), com confirmação da isomeria E/Z para ambos os compostos. O estudo de docking molecular identificou a tiossemicarbazona como o composto de maior escore de afinidade pelo sítio de ligação a cardenolídeos da NKA, formando ligações de hidrogênio com os resíduos Thr797, Gly111 e Asn122. Além disso, o teste de MTT indicou que todos os derivados obtiveram reduzida toxicidade em comparação com a digoxina, onde a digoxigenona, oxima e tiossemicarbazona apresentaram redução de 50% da viabilidade celular a partir de 10 μM e a digoxina a partir de 100 nM. Os resultados obtidos demonstram que as funcionalizações realizadas apresentaram capacidade citotóxica in vitro reduzida nas concentrações nanomolares testadas.