Banca de DEFESA: THAIS PAIVA PORTO DE SOUZA

Uma banca de DEFESA de DOUTORADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : THAIS PAIVA PORTO DE SOUZA
DATA : 09/04/2021
HORA: 08:30
LOCAL: Remoto via plataforma Google Meet
TÍTULO:

Expressão da fitase de Aspergillus nidulans em células de Komagataella phaffii (Pichia pastoris) e análise de sua estabilidade em diferentes pHs por dinâmica molecular.

PALAVRAS-CHAVES:

Fitase, Fitato, Komagataella phaffii, Expressão heteróloga, dinâmica molecular.

PÁGINAS: 164
RESUMO:

O fitato ou ácido fítico (Inositol hexafosfato: C6H18O24P6 – IP6) está presente nas plantas, especialmente em cereais como soja, milho, trigo, aveia e leguminosas. Atualmente, o fitato é considerado um fator antinutricional por se ligar a metais e minerais, como ferro, zinco, cobre e principalmente o fósforo, reduzindo sua absorção durante a digestão em animais monogástricos ou mesmo em humanos. As fitases são enzimas capazes de degradar o ácido fítico e possuem um amplo espectro de aplicação em indústrias, como na suplementação de ração animal com intuito de se melhorar a digestibilidade através da liberação de nutrientes como o fósforo, presente na forma de fitato. Este trabalho diz respeito à construção de uma linhagem da levedura Komagataella phaffii (Pichia pastoris) como sistema de expressão para produção da enzima fitase. Para tanto, um screening de fitases com características biotecnológicas relevantes visando um desenho racional da proposta foi realizado. Fitases de fungos filamentosos se mostram atualmente promissoras, por possuírem propriedades bioquímicas desejáveis para aplicação na indústria animal, como termoestabilidade e estabilidade em diferentes perfis de pH. Diante disso, a fitase de Aspergillus nidulans foi escolhida para produção e a linhagem K. phaffii GS115 foi usada como sistema para expressão. Foram realizadas análises bioinformáticas (análises in silico) da sequência gênica para otimização das sequências obtidas no GenBank. O plasmídeo pPICZα-B contendo a ORF da fitase foi sintetizado e clonado in vitro com códons otimizados para expressão em K. paffi. A partir disso o plasmídeo foi amplificado em cepas de Escherichia coli, posteriormente extraído por preparação em média escala e detectado através de PCR. O vetor foi linearizado com a enzima de restrição Sac I e clonado em K. phaffii GS115. A expressão foi realizada com 0,5% de metanol em diferentes tempos de indução, de modo que as bandas proteicas foram analisadas através de gel de poliacrilamida SDS-PAGE. Os fenótipos dos clones obtidos foram determinados quanto ao metabolismo de metanol. Além disso, foi possível selecionar o clone com maior atividade enzimática frente à hidrólise do fitato de sódio. Também foram realizados estudos de dinâmica molecular e metadinâmica para verificação da estabilidade enzimática em diferentes faixas de potencial hidrogeniônico (pH), em relação à presença e ausência de glicosilação proteica

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1367304 - ALEXSANDRO SOBREIRA GALDINO
Externa à Instituição - LUCIANA DE PAULA NAVES - UFLA
Externo à Instituição - MARINA QUÁDRIO RAPOSO BRANCO RODRIGUES - UNIFAL-MG
Externo à Instituição - ADRIANO GUIMARAES PARREIRA - UEMG
Externo à Instituição - MICHEL RODRIGO ZAMBRANO PASSARINI - UNILA
Externa à Instituição - SABRINA DE AZEVEDO SILVEIRA - UFV