Dissertações/Teses
2021
Dissertações
1
  • WANESSA ALVES ARAÚJO
  • AVALIAÇÃO IN VITRO DO EFEITO DO DIAZEPAM NA ATIVIDADE ATPásica, CONTEÚDO LIPÍDICO E ESTRESSE OXIDATIVO DE MEMBRANAS ERITROCITÁRIAS

  • Orientador : VALERIA ERNESTANIA CHAVES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VALERIA ERNESTANIA CHAVES
  • ANDRE DE OLIVEIRA BALDONI
  • JÚLIO ALBERTO MIGNACO
  • Data: 24/02/2021

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  • Diazepam (DZP) é um dos benzodiazepínicos (BZDs) mais conhecidos, sendo amplamente utilizado como ansiolítico, anticonvulsivante e relaxante muscular. Levando-se em consideração o consumo crescente e indiscriminado de fármacos ansiolíticos em todo o mundo, juntamente com a escassez de trabalhos que avaliem os efeitos de BZDs nas células sanguíneas, além do fato de que, após a administração, o DZP permanece temporariamente na corrente sanguínea, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do DZP, sobre atividade das enzimas Na,K-ATPase e PMCA, integridade da membrana plasmática e parâmetros relacionados ao estresse oxidativo em eritrócitos humanos. Para isso, sangue humano foi incubado com DZP 15 μg/mL (solução injetável ou puro) por 30 e 60 minutos, a temperatura ambiente. Posteriormente, foram realizadas as seguintes etapas: preparação de membrana eritrocitária (ghost), extração lipídica, determinação da fragilidade osmótica, dosagem de fosfolipídios e colesterol totais e avaliação da atividade de enzimas antioxidantes e de parâmetros oxidativos. O tratamento com DZP injetável provocou uma diminuição na atividade da Na,K-ATPase eritrocitária, não apresentando alterações significativas nos demais parâmetros. Já o grupo tratado com DZP puro apresentou uma maior fragilidade osmótica quando comparado ao grupo controle. Foi observado um aumento de 43% no conteúdo de fosfolipídios de membrana após 60 minutos de tratamento. O índice de peroxidação lipídica não foi alterado, mas foi observada uma diminuição nos níveis de H2O2 e nas atividades da CAT e AChE. Além disso, outros marcadores de estresse oxidativo, como GPx e GSH, foram modulados pelo DZP de maneira tempo-dependente, e uma diminuição de 46% na atividade de Na,K-ATPase foi observada após 30 minutos de tratamento. Esses resultados indicam que o DZP foi capaz de alterar importantes parâmetros bioquímicos nos eritrócitos, como fragilidade osmótica, conteúdo lipídico, estresse oxidativo e atividade ATPásica da membrana de maneira tempo-dependente. Assim, os diversos efeitos aqui observados ressaltam a importância de estudos que avaliem o efeito dos BZDs nos eritrócitos, motivando o uso consciente e controlado desses fármacos e a busca de tratamentos alternativos, uma vez que o uso prolongado do DZP por indivíduos que já se encontram debilitados por doenças que comprometem as células sanguíneas pode afetá-los de maneira significativa.


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  • Diazepam (DZP) is one of the most well-known benzodiazepines (BZDs), being widely used as an anxiolytic, anticonvulsant and muscle relaxant. Considering the increasing and indiscriminate consumption of anxiolytic drugs worldwide, together with the scarcity of studies that evaluate the effects of BZDs on blood cells, in addition to the fact that, after administration, DZP remains temporarily in the current blood, the aim of the present study was to evaluate the effect of DZP on the Na,K-ATPase and PMCA activities, plasma membrane integrity and parameters related to oxidative stress in human erythrocytes. For this, human blood was incubated with DZP 15 μg/mL (injectable or pure) for 30 and 60 minutes, at room temperature. Subsequently, the following steps were performed: preparation of erythrocyte membrane (ghost), lipid extraction, determination of osmotic fragility, dosage of total phospholipids and cholesterol and evaluation of the activity of antioxidant enzymes and oxidative parameters. Treatment with injectable DZP caused a decrease in the Na, K-ATPase activity, with no significant changes in the other parameters. The group treated with pure DZP showed a greater osmotic fragility when compared to the control group. A 43% increase in membrane phospholipid content was observed after 60 minutes of treatment. The lipid peroxidation index was not altered, but a decrease in H2O2 levels and in CAT and AChE activities was observed. In addition, other oxidative stress markers, such as GPx and GSH, were modulated by DZP in a time-dependent manner, and a 46% decrease in Na, K-ATPase activity was observed after 30 minutes of treatment. These results indicate that DZP was able to alter important biochemical parameters in erythrocytes, such as osmotic fragility, lipid content, oxidative stress and ATPasic activity of the membrane in a time-dependent manner. Thus, the several effects observed here reinforce the importance of studies that evaluate the effect of BZDs on erythrocytes, motivating the conscious and controlled use of these drugs and the search for alternative treatments, since the prolonged use of DZP by individuals who are already weakened by diseases that compromise blood cells can significantly affect them.

2
  • ANA AMÉLIA MAIA SILVA
  • Expressão da amilase de Cryptococcus flavus em células de Pichia pastoris (Komagataella phaffii) para aplicações em indústrias

  • Orientador : ALEXSANDRO SOBREIRA GALDINO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALEXSANDRO SOBREIRA GALDINO
  • LEONARDO HENRIQUE FRANCA DE LIMA
  • MARIA DE LOURDES BORBA MAGALHÃES
  • Data: 27/08/2021

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  • A expressão de proteínas recombinantes por meio de sistemas heterólogos é uma alternativa para produção de enzimas recombinantes. Os modelos disponíveis apresentam maquinário adequado para aumentar os níveis de produção de determinada proteína, permitir uma produção mais rápida e com níveis de produções superiores aos sistemas nativos, e fornecer segurança biológica ao produto produzido. Este trabalho refere-se à construção de uma linhagem da levedura Pichia pastoris (Komagataella phaffii) para a superprodução da enzima amilase de Cryptococcus flavus, a partir de metanol como fonte de carbono. A enzima α-amilase de C. flavus apresenta características interessantes do ponto de vista biotecnológico, como estabilidade térmica e manter sua atividade funcional em uma ampla faixa de pH. O gene rpAMY1 foi sintetizado in vitro com códons otimizados para expressão em K. phaffii no vetor de pPICZα-B. A partir disso, fez-se a amplificação do material genético e a transformação da levedura com o plasmídeo recombinante. Em seguida, o potencial de hidrólise do amido dos clones recombinantes pré-selecionados foi avaliado qualitativa e quantitativamente. Os resultados preliminares mostraram que o gene da α-amilase foi expresso com sucesso em células de K. phaffii e dois clones recombinantes são fortes candidatos para aplicações biotecnológicas da enzima expressa, por apresentaram valores de atividade enzimática superiores aos já encontrados na literatura, quando expresso em seu hospedeiro nativo quanto na hospedeira Saccharomyces cerevisiae.


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  • The expression of recombinant proteins through heterologous systems is an alternative for the production of recombinant enzymes. The available models have adequate machinery to increase the production levels of a certain protein, allow a faster production and with production levels higher than native systems, and provide biological safety to the product produced. This work refers to the construction of a strain of the yeast Pichia pastoris (Komagataella phaffii) for the overproduction of the enzyme amylase from Cryptococcus flavus, from methanol as a carbon source. The C. flavus α-amylase enzyme has interesting characteristics from a biotechnological point of view, such as thermal stability and maintaining its functional activity over a wide pH range. The rpAMY1 gene was synthesized in vitro with codons optimized for expression in K. phaffii in the pPICZα-B vector. From that, the genetic material was amplified and the yeast was transformed with the recombinant plasmid. Then, the starch hydrolysis potential of the pre-selected recombinant clones was assessed qualitatively and quantitatively. Preliminary results showed that the α-amylase gene was successfully expressed in K. phaffii cells and two recombinant clones are strong candidates for biotechnological applications of the expressed enzyme, as they showed higher enzyme activity values than those found in the literature, when expressed in their native host and Saccharomyces cerevisiae

Teses
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  • LORENA SALES FERREIRA
  • Alterações histológicas e bioquímicas em larvas de Culex quinquefasciatus após a exposição a potenciais pesticidas
  • Orientador : STENIO NUNES ALVES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • HERICA DE LIMA SANTOS
  • LEANDRO AUGUSTO DE OLIVEIRA BARBOSA
  • MAGNO AUGUSTO ZAZA BORGES
  • RALPH GRUPPI THOME
  • SUZAN KELLY VILELA BERTOLUCCI
  • Data: 12/02/2021

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  • O mosquito Culex quinquefasciatus é predominante em áreas urbanas em muitos países tropicais e é responsável pela transmissão de diversas doenças. Desta forma, diferentes substâncias são utilizadas como a principal forma de combater este inseto vetor, entretanto, os pesticidas utilizados têm sido pouco eficientes no combate aos mosquitos. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a ação de seis classes de xenobióticos: Revolution (selamectina), Bravecto (fluralaner), Tiger® 100 EC (piriproxifem), Actara® 250 WG (tiametoxam), Vectobac® WG (Bacillus thurigiensis var israelenses- Bti) e Original Neem® (azadiractina) sobre larvas de 3º instar de C. quinquefasciatus. Os pesticidas foram obtidos comercialmente e o principio ativo do Bravecto, extraído e caracterizados por técnicas de ponto de fusão e espectroscopia na região do infravermelho. A CL50 foi determinada e a avaliação histológica e bioquímica realizada após a exposição das larvas a CL50 por 24 horas. Os pesticidas apresentaram as seguintes doses letais: 1,07x10-2 mgL-1 (selamectina); 1,90x10-5 mgL-1 (fluralaner); 2,2x10-3 mgL-1 (piriproxifem); 3x10-2 mgL-1 (tiametoxam); 9x10-2 mgL-1 (Bti) e 4x10-2 mgL-1 (azadiractina) mgL-1 , sendo assim, o fluralaner o inseticida mais potente. A partir da análise bioquímica observou-se um aumento em comparação ao controle dos parâmetros analisados nas larvas, sendo eles, a concentração de proteínas totais e estresse oxidativo através do teor glutationa reduzida e peróxido de hidrogênio, quando expostas a todos os pesticidas, com exceção do fluralaner, o qual apresentou efeito inverso (diminuição no nível dos parâmetros bioquímicos analisados). Em relação a acetilcolinesterase, a atividade enzimática diminui quando comparado ao controle para o pesticida Revolution, mas aumentou quando as larvas foram tratadas com os demais compostos. Por sua vez, as análises histológicas mostraram dano celular no intestino médio, alterações na borda estriada e instabilidade da membrana peritrófica. Neste contexto, os resultados obtidos, mostraram informações que ajudaram a compreender melhor os efeitos dos xenóbioticos sobre as larvas, e apresentaram novos compostos com potencial atividade larvicida contra os mosquitos.


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  • The Culex quinquefasciatus mosquito is prevalent in urban areas in many tropical countries and is responsible for the transmission of several diseases. In this way, different substances are used as the main way to combat this insect vector, however, mosquitoes have shown resistance to the pesticides currently used. In this context, the present work aimed to evaluate the action of six classes of xenobiotics: Revolution (selamectin), Bravecto (fluralaner), Tiger® 100 EC (pyriproxifem), Actara® 250 WG (thiametoxam), Vectobac® WG (Bacillus thurigiensis var israelenses- Bti) and Original Neem® (azadiractin) on 3rd instar larvae of C. quinquefasciatus. The pesticides were obtained commercially and the active ingredient of Bravecto, extracted and characterized by melting point techniques and spectroscopy in the infrared region. The LC50 was determined and the histological and biochemical evaluation was performed after the larval exposure the LC50 for 24 hours. The pesticides had the following lethal doses: 1,07x10-2 mgL1 (selamectin); 1,90x10-5 mgL-1 (fluralaner); 2,2x10-3 mgL-1 (pyriproxifem); 3x10-2 mgL-1 (thiametoxam); 9x10-2 mgL-1 (Bti) e 4x10-2 mgL-1 (azadiractin) mgL-1 , making the fluralaner the most potent insecticide. From the biochemical analysis, there was an increase compared to the control of the parameters analyzed in the larvae, namely, the concentration of total proteins and oxidative stress through the reduced glutathione and hydrogen peroxide content, when exposed to all pesticides, except fluralaner, which had the opposite effect (decrease in the level of the biochemical parameters analyzed). In relation to acetylcholinesterase, the enzymatic activity decreased when compared to the control for the pesticide Revolution, but increased when the larvae were treated with the other compounds. In turn, histological analysis showed cell damage in the midgut, changes in the striated border and instability of the peritrophic membrane. In this context, the results obtained showed information that helped to better understand the effects of xenobiotics on larvae, and presented new compounds with potential larvicidal activity against mosquitoes.

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  • DUANE GISCHEWSKI PEREIRA
  • AVALIAÇÃO DO EFEITO SINÉRGICO ENTRE DIGOXINA E CISPLATINA NA SINALIZAÇÃO E ESTRESSE CELULAR

  • Orientador : VANESSA FARIA CORTES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VANESSA FARIA CORTES
  • VALERIA ERNESTANIA CHAVES
  • RAFAEL GONCALVES TEIXEIRA NETO
  • MARCUS FERNANDES DE OLIVEIRA
  • VICTOR DO VALLE PEREIRA MIDLEJ
  • Data: 23/02/2021

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  • Os esteróides cardiotônicos têm sido usados como fármacos cardíacos por mais de 200 anos e, atualmente vários estudos demonstram interessantes efeitos antitumorais com esteróides cardiotônicos para uma série de culturas celulares. A cisplatina tem desempenhado um papel crucial na quimioterapia e tratamentos anticâncer há mais de 30 anos. Porém, o tratamento com cisplatina pode causar efeitos colaterais graves, como mielossupressão, ototoxicidade e nefrotoxicidade, além dos processos de resistência celulares, já descritos na utilização prolongada da droga. Estudos anteriormente publicados, por nosso grupo de pesquisa, demonstraram um potente efeito sinérgico antitumoral entre digoxina 1nM e cisplatina 1µM em células de câncer de colo uterino (HeLa), além de elucidar uma possível via de sinalização que estaria desencadeando o processo antitumoral, onde foi demonstrado o efeito do tratamento combinado frente a atividade e expressão da Na,K-ATPase e o envolvimento de Src. O objetivo do presente trabalho é demonstrar o efeito do tratamento combinado entre digoxina e cisplatina sobre a ativação de Src, através de ensaios de expressão proteica e, o efeito do tratamento combinado sobre parâmetros de estresse oxidativo em células HeLa. Além de demonstrar o efeito do tratamento em outras linhagens celulares, tumoral e normal. O tratamento combinado demonstrou aumentar a expressão de Src fosforilada no resíduo de ativação (Tyr416), comprovando o envolvimento de Src no seu efeito citotóxico. Analisando os parâmetros de estresse oxidativo, observamos uma redução significativa em mecanismos de defesa antioxidantes celulares, atividade de SOD e conteúdo de GSH e, um aumento em 24 horas no conteúdo de H2O2, comprovando o aumento do estresse oxidativo celular frente ao tratamento combinado. Além disso, foram avaliados os níveis de peroxidação lipídica e formação de gotículas lipídicas, onde foi observado um aumento desses parâmetros após 48 horas de tratamento, o que já é descrito comumente em casos de estresse oxidativo. Frente às outras linhagens celulares testadas, A549 (células epiteliais de câncer de pulmão) e WI-38 (células normais de fibroblasto humano), o tratamento combinado não teve a capacidade de alterar significativamente a viabilidade celular em comparação ao controle. Nossos experimentos sugerem que o efeito antitumoral do tratamento sinérgico entre digoxina e cisplatina em células HeLa, parece estar correlacionado com o aumento de estresse oxidativo nesse tipo celular, mediante ativação de Na,K-ATPase/Src/EROS o que por sua vez, poderia culminar em diferentes efeitos celulares como, efeitos sinalizatórios, antiproliferativos e apoptóticos.


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  • Cardiotonic steroids have been used as cardiac drugs for over 200 years and currently several studies have shown interesting anti-tumor effects with cardiotonic steroids for a number of cell cultures. Cisplatin has played a crucial role in chemotherapy and anticancer treatments for over 30 years. However, treatment with cisplatin can cause serious side effects such as myelosuppression, ototoxicity and nephrotoxicity, in addition to the cellular resistance processes already described in prolonged use of the drug. Studies previously published by our research group have shown a potent synergistic antitumor effect between 1nM digoxin and 1µM cisplatin in cervical cancer (HeLa) cells, and elucidate a possible signaling pathway that would be triggering the antitumor process, where the effect of combined treatment on Na, K-ATPase activity and expression and Src involvement was demonstrated. The aim of the present work is to demonstrate the effect of combined treatment between digoxin and cisplatin on Src activation, through protein expression assays and the effect of combined treatment on oxidative stress parameters in HeLa cells. In addition to demonstrating the effect of treatment on other cell lines, tumor and normal. Combination treatment has been shown to increase phosphorylated Src expression in the activation residue (Tyr416), proving Src involvement in its cytotoxic effect. Analyzing the parameters of oxidative stress, we observed a significant reduction in cellular antioxidant defense mechanisms, SOD activity and GSH content and an increase in 24 hours in H2O2 content, confirming the increased cellular oxidative stress across the combined treatment. In addition, the levels of lipid peroxidation and lipid droplet formation were evaluated, where an increase of these parameters was observed after 48 hours of treatment, which is commonly described in cases of oxidative stress. Compared to other cell lines tested, A549 (lung cancer epithelial cells) and WI-38 (normal human fibroblast cells), the combined treatment did not have the ability to significantly alter cell viability compared to control. Our experiments suggest that the antitumor effect of synergistic treatment between digoxin and cisplatin in HeLa cells seems to be correlated with increased in the oxidative stress in this cell type by Na, K-ATPase / Src / ROS activation which in turn could culminating in different cellular effects such as signaling, antiproliferative and apoptotic effects.

2020
Dissertações
1
  • VITÓRIA REGINA FERNANDES
  • ANÁLISE DA ASSIMETRIA MORFOLÓGICA E DE ASPECTOS MOLECULARES DOS HIPOCAMPOS DE PACIENTES COM EPILEPSIA DO LOBO TEMPORAL SUBMETIDOS A TRATAMENTO CIRÚRGICO

  • Orientador : LUCIANA ESTEFANI DRUMOND DE CARVALHO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LEANDRO AUGUSTO DE OLIVEIRA BARBOSA
  • LUCIANA ESTEFANI DRUMOND DE CARVALHO
  • MÁRCIO FLÁVIO DUTRA MORAES
  • Data: 28/02/2020

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  • As epilepsias são desordens neurológicas manifestadas por crises epilépticas espontâneas e recorrentes, causadas por descargas neuronais hipersincronizadas. A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) possui alta prevalência e elevada farmacorresistência, podendo evoluir com alterações morfológicas e moleculares no hipocampo, sendo necessário tratamento cirúrgico. Este trabalho visa estudar os parâmetros morfológicos e fatores moleculares relacionados à excitabilidade e à apoptose em regiões hipocampais de pacientes com ELT com início ictal à direita ou esquerda, submetidos ao tratamento cirúrgico, considerando avaliar novos alvos neuroprotetores. A avaliação morfológica hipocampal foi realizada pela análise do volume em Ressonância Magnética e parte do tecido removido pela cirurgia foi avaliado por western blot para quantificar proteínas envolvidas com a excitabilidade (Na+, K+-ATPase e GluR1) e com a via apoptótica (fator indutor de apoptose [AIF], citocromo c, caspases 8 e 3). Adicionalmente, foi avaliado o índice de correlação entre os fatores morfológicos e moleculares. A amostra foi composta por 18 pacientes, 13 pacientes operados à esquerda (ELTE) e 5 operados à direita (ELTD). Houve diminuição significativa no lado do início ictal quando se compara volume hipocampal total e regiões de cabeça e cauda com o lado contralateral, tanto de ELTE como ETLD, exceto para cauda de ELTD. Quando comparado com valores de indivíduo normais, atrofia do lado do início ictal em pacientes ELTD e ELTE, além de atrofia da cauda do hipocampo contralateral de ELTE. Quanto à expressão proteica, não foram encontradas diferenças quando se compara pacientes ELTE e ELTD em tecido de cabeça ou cauda hipocampal. Além disso, sugere-se que há correlação negativa entre o volume e a expressão de caspase-3, AIF, citocromo c, GluR1, α3 e α1 na cauda hipocampal, e na cabeça hipocampal para caspase 3, caspase 8, AIF, citocromo c, FXYD2, α3 e α1. Caspase 8 teve correlação positiva com cauda. GluR1 e α2 não apresentaram correlação com volume da cabeça e α2 e FXYD2 com volume da cauda hipocampal. Em síntese, existe presença de atrofia do lado ipsilateral ao início ictal, além de haver correlação entre volume hipocampal e expressão de algumas proteínas analisadas. Entretanto não foi observada diferença molecular entre cabeça e cauda hipocampais em ELTE e ELTD, não sendo possível estabelecer especificidade quanto à lateralidade ou as regiões hipocampais.


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  • The epilepsies are neurological disorders manifested by spontaneous and recurring epileptic seizures, caused by hyper-synchronized neuronal discharges. Temporal lobe epilepsy (TLE) has high prevalence and resistance to drug treatment, with possible evolution causing morphological and molecular alterations in the hippocampus, making surgical intervention necessary to stop the evolution. This work aims to study the morphological parameters and molecular factors related to excitability and apoptosis in hippocampal regions of TLE patients with a right or left onset, who underwent surgery to evaluate new potential neuroprotection targets. Hippocampal morphological evaluation was performed by the volume determination using magnetic resonance imaging and part of the removed tissue during surgery was analyzed by western blot to quantify proteins involved in excitability (Na+, K+-ATPase and GluR1) and the apoptotic pathway (apoptosis inducing factor [AIF], cytochrome c, caspases 8 and 3). Moreover, the correlation coefficient of morphological and molecular parameters was evaluated. The sample was composed of 18 patients, 13 who had surgery on the left side (TLEL) and 5 who had surgery on the right (TLER) side. There was significant decrease in volume when comparing contralateral side of total hippocampus and its regions of TLER patients, except the hippocampal tail, of TLEL patients. Atrophy was observed when comparing volumes of healthy hippocampi and the ictal onset zone of both TLEL and TLER patients and atrophy of contralateral hippocampal tail in ELTE. Protein expression was not significantly different in neither hippocampal head or tail nor when comparing TLEL and TLED patients. Besides, it is suggested that there is a negative correlation between volume and the expression of caspase-3, AIF, cytochrome c, GluR1, α3 and α1 in hippocampal tail. Hippocampal head showed a negative correlation for caspase 3, caspase 8, AIF, cytochrome c, FXYD2, α3 and α1. Caspase 8 showed a positive correlation with tail. GluR1 and α2 did not show correlation with head volume neither do α2 and FXYD2 with head volume. In summary, there is atrophy in the ipsilateral to the ictal onset zone, in addition to the presence of correlation between hippocampal volume and expression of some of the proteins analyzed. However, no molecular difference was observed between hippocampal head and tail in ELTE and ELTD, thus, it isn’t possible to stablish specificity to the laterality or hippocampal regions.

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  • GISELE SILVA MAIA
  • Avaliação de proteínas associadas à sinalização de cálcio e apoptose em hipocampo de ratos tratados com Ouabaína e induzidos a neuroinflamação por lipopolissacarídeos

  • Orientador : LUCIANA ESTEFANI DRUMOND DE CARVALHO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ANDRE RICARDO MASSENSINI
  • LUCIANA ESTEFANI DRUMOND DE CARVALHO
  • VANESSA FARIA CORTES
  • Data: 28/08/2020

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  • As doenças neurodegenerativas são enfermidades incuráveis e debilitantes, que afetam a função dos neurônios, podendo culminar em morte neuronal e prejuízos importantes ao indivíduo. O processo inflamatório tem sido relatado como fator presente em várias doenças neurológicas, que podem comprometer a função do retículo endoplasmático e mitocôndria, desregulando a homeostase de cálcio, em células neurais. Em estudos anteriores vimos que, a ouabaína quando administrada em concentrações nanomolares é capaz de atenuar o estresse oxidativo, protegendo a membrana celular da neuroinflamação promovida por lipopolissacarídeos (LPS), em hipocampo de ratos Wistar. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo investigar o efeito da ouabaína sobre componentes da sinalização e homeostase do cálcio e apoptose em modelo de neuroinflamação induzida por LPS, a fim de esclarecer os possíveis mecanismos de ação da ouabaína que possam justificar seus efeitos protetores na célula neuronal. Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos os quais receberam uma administração intraperitoneal (i.p) de salina ou ouabaína (1,8 μg. kg -1), e após 20 minutos foi administrada uma segunda injeção de salina ou de LPS (200 μg. kg -1). Passadas 2 horas os animais foram eutanasiados e os hipocampos foram removidos. A neuroinflamação foi analisada pelo estresse nitrosativo através da expressão da proteína iNOS. Para a expressão proteica da via de sinalização de cálcio foram analisadas a NCS-1, IP3R, MCU e a subunidade GluR1 do receptor de glutamato AMPA. Para analisar a disfunção mitocondrial e morte celular foi analisada a via de apoptose mitocondrial independente de caspase, através da expressão de AIF. Nosso trabalho demonstrou que a OUA em baixa concentração, administrada isoladamente, não altera nenhum dos parâmetros avaliados. Além disso, houve um aumento na expressão de IP3R em ratos administrados com LPS e para as proteínas NCS-1 e MCU houve aumento significativo para o grupo OUA + LPS, quando comparados ao grupo controle. Para as proteínas iNOS, AIF e GluR1 não houve diferença entre os grupos. Sendo assim, os resultados demonstram que há alterações em fatores que contribuem com a homeostase do cálcio, em ratos tratados com ouabaína e induzidos a neuroinflamação pelo do LPS, sugerindo que a ouabaína pode estar interferindo nos parâmetros citados impedindo a instalação dos danos ocasionados pelo LPS.


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  • Neurodegenerative diseases are incurable and debilitating diseases, which affect the function of neurons, which can culminate in neuronal death and important damage to the individual. The inflammatory process has been reported as a factor present in several neurological diseases, which can compromise the function of the endoplasmic reticulum and mitochondria, disrupting calcium homeostasis in neural cells. In previous studies we have seen that, when administered in nanomolar concentrations, ouabain is able to attenuate oxidative stress, protecting the cell membrane from neuroinflammation promoted by lipopolysaccharides (LPS) in the hippocampus of Wistar rats. In this context, this study aimed to investigate the effect of ouabain on components of calcium signaling and homeostasis and apoptosis in a model of neuroinflammation induced by LPS, in order to clarify the possible mechanisms of action of ouabain that may justify its protective effects on the cell. neuronal. Male Wistar rats were divided into four groups which received an intraperitoneal (ip) administration of saline or ouabain (1.8 μg. Kg -1), and after 20 minutes a second injection of saline or LPS (200 μg. kg -1). After 2 hours the animals were euthanized and the hippocampi were removed. Neuroinflammation was analyzed by nitrosative stress through the expression of the iNOS protein. For protein expression of the calcium signaling pathway, NCS-1, IP3R, MCU and the GluR1 subunit of the AMPA glutamate receptor were analyzed. To analyze mitochondrial dysfunction and cell death, the pathway of mitochondrial apoptosis independent of caspase was analyzed through the expression of AIF. Our work demonstrated that the OUA in low concentration, administered in isolation, does not alter any of the evaluated parameters. In addition, there was an increase in the expression of IP3R in rats administered with LPS and for the NCS-1 and MCU proteins there was a significant increase for the OUA + LPS group, when compared to the control group. For iNOS, AIF and GluR1 proteins there was no difference between groups. Thus, the results demonstrate that there are changes in factors that contribute to calcium homeostasis in rats treated with ouabain and induced to neuroinflammation by LPS, suggesting that ouabain may be interfering with the parameters mentioned preventing the installation of damage caused by LPS. 

Teses
1
  • LILIAN NARA DAVID E SILVA
  • Avaliação do envolvimento da cavéola no efeito de esteroides cardiotônicos

  • Orientador : VANESSA FARIA CORTES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VANESSA FARIA CORTES
  • HERICA DE LIMA SANTOS
  • OTACÍLIO DA CRUZ MOREIRA
  • MARIA DAS GRACAS CARVALHO
  • JÚLIO ALBERTO MIGNACO
  • Data: 17/02/2020

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  • A composição lipídica e a fluidez da membrana plasmática podem ser alteradas pelos esteroides cardiotônicos e, consequentemente essa modulação lipídica pode afetar diretamente a função da Na, K-ATPase. Sabe-se que interação da Na,K-ATPase com caveolina-1 tem sido associada a manutenção da homeostase do colesterol nas células. Dessa forma, o principal objetivo do estudo foi avaliar o envolvimento da caveolina-1 na modulação lipídica da membrana plasmática causada por esteroides cardiotônicos. Para isso, utilizamos uma linhagem celular que possui cavéolas (HeLa), e uma linhagem celular que não possui o microdomínio (Caco-2). Avaliamos o efeito do tratamento com ouabaína ou 21-BD sobre a modulação do conteúdo de fosfolipídios totais por meio de métodos colorimétricos e incorporação de fosfato radioativo. Avaliamos a composição dos fosfolipídios, identificando o teor de fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol, esfingomielina e lisofosfatidilcolina, por HPTLC. Para investigar os efeitos do tratamento com os esteroides cardiotônicos sobre a modulação do colesterol da membrana, avaliamos o conteúdo e distribuição desse lipídio por filipina; e analisamos a expressão de caveolina-1. A ouabaína não teve efeito sobre o conteúdo de colesterol e fosfolipídios totais damembrana plasmática, embora tenha alterado pontualmente alguns fosfolipídios específicos nas duas linhagens celulares. A 21-BD aumentou o conteúdo dos fosfolipídios totais da membrana, elevando o teor de praticamente todos os fosfolipídios específicos. O tratamento com 21-BD não alterou o conteúdo de colesterol da membrana de células Caco-2, no entanto, notamos uma maior fluorescência emitida por filipina, indicando um maior percentual de colesterol em células HeLa. Além disso, somente a 21-BD causou uma redistribuição do colesterol para a região perinuclear das células HeLa e Caco-2. A expressão de caveolina-1 não foi alterada após o tratamento com os esteroides cardiotônicos. Portanto, demonstramos que os esteroides cardiotônicos testados, ouabaína e 21-BD, causaram alterações na composição lipídica que podem resultar na mudança da fluidez da membrana. Além disso, observamos mudanças no conteúdo de fosfolipídios importantes para diferentes funções celulares. Embora o colesterol tenha sido redistribuído nas duas linhagens celulares, foi observado um aumento do conteúdo desse lipídio somente nas células que possuem cavéolas. No entanto, a caveolina-1 não parece estar envolvida no aumento de colesterol, porém pode ter um papel fundamental no transporte do colesterol para a membrana plasmática.


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  • The lipid composition and fluidity of the plasma membrane can be altered by cardiotonic steroids and, consequently, this lipid modulation can directly affect the function of Na, K-ATPase. The interaction of Na, K-ATPase with caveolin-1 has been associated with the maintenance of cholesterol homeostasis in cells. Thus, the aim of this study was to evaluate the involvement of caveolin-1 in the lipid modulation of the plasma membrane caused by cardiotonic steroids. For this, we used a cell line that has caveolae (HeLa cells), and a cell line that doesn’t have this microdomain (Caco-2 cells). We evaluated the effect of treatment with ouabain or 21-BD on the modulation of the content of total phospholipids of these cells, by using colorimetric methods and incorporation of radioactive phosphate. We also evaluated the composition of phospholipids, identifying the content of phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylcholine, phosphatidylinositol, sphingomyelin and lysophosphatidylcholine, by HPTLC. To investigate the effects of treatment with cardiotonic steroids on the modulation of membrane cholesterol, we evaluated the content and distribution of this lipid by Filipin and analyzed the expression of caveolin-1. Ouabain and 21-BD had different effects on the modulation of the lipid profile of the two cell lines. Ouabain had no effect on the total content of membrane phospholipids, although it did occasionally alter some specific phospholipids in the two cell lines. Treatment with 21-BD did not alter the cholesterol content of Caco-2 cell membranes, however, a higher fluorescence indicating a percentage of higher cholesterol in HeLa cells. Futhermore, only 21-BD caused a redistribution of cholesterol to the perinuclear region of HeLa and Caco-2 cells. Caveolin-1 expression didn’t change after treatment with cardiotonic steroids. Therefore, we demonstrate that the cardiotonic steroids, ouabain and 21-BD, caused changes in the lipid composition resulting in a change in the fluidity of the membrane. In addition, we observed changes in the phospholipid content important for different cellular functions. Although cholesterol was redistributed in the two cell lines, an increase in the content of this lipid was observed only in cells that have caveolae, however, caveolin-1 does not seem to be involved in this effect.

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  • GISELE CAPANEMA DE OLIVEIRA
  • Efeitos citotóxicos de novos esteroides cardiotônicos derivados da digitoxina em células tumorais e o envolvimento NA,K-ATPASE

  • Orientador : VANESSA FARIA CORTES
  • MEMBROS DA BANCA :
  • VANESSA FARIA CORTES
  • LUCIANA ESTEFANI DRUMOND DE CARVALHO
  • HERICA DE LIMA SANTOS
  • SEBASTIÃO ROBERTO TABOGA
  • LUIS EDUARDO MENEZES QUINTAS
  • Data: 18/02/2020

  • Mostrar Resumo
  • Os esteroides cardiotônicos (CTS) são fármacos utilizados para tratamento da insuficiência cardíaca, e conhecidos por sua capacidade de inibir a atividade da Na,K-ATPase (NKA). Os CTS vêm sendo estudados como antitumorais por modular mecanismos celulares envolvidos na proliferação e progressão tumoral. Diante do crescente interesse na pesquisa com os CTS, novos derivados da digitoxina foram sintetizados (DGIB1 e DGIB5) e seus efeitos celulares, bem como a modulação da NKA foram investigados. A citotoxicidade de DGIB1 e DGIB5 foi avaliada em tratamento por 48 horas nas diferentes linhagens celulares em cultivo: células de câncer HeLa, RKO, PC3 e A549 e também nas células não tumorais WI-26VA4. O efeito citotóxico de DGIB1 e DGIB5 foi na faixa de concentrações micromolares em todas as células, e IC50 entre 5 a 11 µM e a digitoxina na faixa nanomolar. As células de pulmão A549 e WI26VA4 foram selecionadas para avaliação dos efeitos celulares dos CTS e modulação da NKA, como a atividade da enzima, expressão das subunidades α1 e ꞵ1 na membrana e sua localização intracelular. DGIB1 inibiu a atividade da enzima e reduziu a expressão de α1 na membrana das células A549 intactas, sem efeito direto na NKA obtida da membrana isolada de A549 ou da NKA purificada de rim de porco. DGIB1 também provocou a internalização de α1 e ꞵ1, visualizadas por imunofluorescência que pode estar relacionado ao efeito inibitório observado. Já na célula WI-26VA4, DGIB1 reduziu a atividade da NKA sem alterar a expressão de α1. DGIB5 reduziu a atividade da NKA e a expressão de α1 na membrana de A549. Também reduziu a atividade da membrana de A549 isolada. DGBI5 não alterou a atividade em WI26VA4, e também não altera a NKA purificada, sugerindo que a ação é isoforma dependente. Somente a digitoxina alterou a expressão da subunidade ꞵ1, sugerindo que os novos CTS possam manter a adesão celular. Ambos CTS levaram ao acúmulo de gotículas lipídicas (ou “lipid droplets” - LD) e vesículas autofágicas (AV), que foram visualizadas através da microscopia eletrônica de transmissão (MET). O aumento de LD foi intenso com DGIB1, que também induziu a mobilização do colesterol intracelular, a formação de corpos apoptóticos e fragmentação nuclear. Já o acúmulo de AV foi maior com DGIB5. Estes dados sugerem que via da autofagia e/ou apoptose podem estar envolvidas no mecanismo de morte celular desencadeados pelos novos CTS, e que precisam ser melhor investigados através de marcadores específicos de cada via.


  • Mostrar Abstract
  • Cardiotonic steroids (CTS) are drugs used for heart failure, and are known for their ability to inhibit the Na, K-ATPase (NKA) activity. CTS have been studied as antitumor by modulating cellular mechanisms involved in tumor proliferation and progression. Due to the increasingly interest in research with CTS, new digitoxin derivatives were synthesized (DGIB1 and DGIB5) and their cellular effects, such as NKA modulation, were investigated. The DGIB1 and DGIB5 cytotoxicity was evaluated in treatment for 48 hours in the different cell lines in culture: HeLa, RKO, PC3 and A549 cancer cells, and also in WI-26VA4 non-tumor cells. The cytotoxic effect of DGIB1 and DGIB5 was in the range of micromolar concentrations in all cells, with an IC50 between 5 and 11 µM and digitoxin at the nanomolar range. The lung cells A549 and WI26VA4 were selected to evaluate the cellular effects of CTS and NKA modulation, such as enzyme activity, expression of α1 and ꞵ1 subunits in the membrane and their intracellular location. DGIB1 inhibited the enzyme activity and reduced the α1 expression in intact A549 cell membrane, with no direct effect on the NKA obtained from the A549 isolated membrane or purified pig kidney enzyme. DGIB1 also led to α1 and ꞵ1 internalization 1, visualized by immunofluorescence and it is possible related with the enzyme activity inhibition. In the WI26VA4 cell, DGIB1 reduced the activity without modulating the α1 expression. DGIB5 reduced the NKA activity and reduced α1expression in the A549 membrane. It also reduced the activity of the isolated A549 membrane. DGBI5 did not alter the activity in WI-26VA4 cells, and also did not alter the NKA purified, suggesting a isoform dependent effect. Only digitoxin altered the expression of the ꞵ1 subunit, suggesting that the new CTS may maintain cell adhesion. Both CTS led to the accumulation of lipid droplets (LD) and autophagic vesicles (AV), which were visualized through transmission electron microscopy (TEM). The increase in LD was intense with DGIB1, which also induced the mobilization of intracellular cholesterol, the formation of apoptotic bodies and nuclear fragmentation. The accumulation of AV was higher with DGIB5. These data suggest that the path of autophagy and/or apoptosis may be involved in the mechanism of cell death triggered by the new CTS, and that they need to be further investigated through specific markers for each pathway.

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  • MARIA JULIANA FERREIRA PASSOS
  • Avaliação, in vitro e in vivo, do efeito antitumoral das frações de Macairea radula sobre linhagens de glioblastoma humano

  • Orientador : ROSY IARA MACIEL DE AZAMBUJA RIBEIRO
  • MEMBROS DA BANCA :
  • MARIA LUIZA VILELA OLIVA
  • REMO DE CASTRO RUSSO
  • FERNANDO DE PILLA VAROTTI
  • LEANDRO AUGUSTO DE OLIVEIRA BARBOSA
  • ROSY IARA MACIEL DE AZAMBUJA RIBEIRO
  • Data: 24/04/2020

  • Mostrar Resumo
  • O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de neoplasia mais agressiva do sistema nervoso central. Apesar de raro, apresenta péssimo prognóstico e taxa de sobrevida baixa. As estatísticas mostram o aumento da incidência do câncer com tendência linear de crescimento da taxa de mortalidade. Além disso, o GBM não possui cura. Embora alguns tratamentos já estejam estabelecidos contra este tipo de tumor, são conhecidos por serem altamente invasivos. Neste contexto, busca-se como alternativa a amplitude de compostos secundários que os produtos naturais podem oferecer, com propriedades biológicas e terapêuticas. Diante disso, o objetivo do trabalho foi avaliar a capacidade antitumoral de derivados da espécie Macairea radula sobre linhagens celulares de glioma humano. Primeiramente, como controle positivo, foi avaliada a citotoxicidade da Temozolamida (TMZ) sobre as linhagens tumorais (U251 e GAMG) e sobre a linhagem de astrócito normal - NHA, por 24 e 72 horas. A partir da concentração inibitória determinada, foi calculado o Índice de Seletividadade Tumoral (IS) do quimioterápico. Foi observado que a TMZ não apresentou seletividade para nenhuma das linhagens tumorais estudadas. Paralelamente, as partições Hexânica e Clorofórmica da M. radula foram selecionadas através de triagem prévia para fracionamento por cromatografia em coluna. Foram obtidas 6 frações derivadas da partição B e 8 derivadas da partição C. Foi avaliada a citotoxicidade de 12 das frações obtidas, concomitantemente às partições B e C sobre as linhagens U251, GAMG e NHA, em 24 e 72 horas. Após determinada a CI50, foi calculado o IS de cada um dos correspondentes extratos. Aquelas frações que apresentaram maior IS com CI50 de 72 horas foram selecionadas para os posteriores ensaios - 23-B3, 23-B4, 23-B5 e 23-C6. Alterações morfológicas características, em resposta à citotoxicidade das frações, foram observadas. Em corroboração, foi realizada a caracterização de morte celular, através do ensaio por fluorescência. Foi observado que houve aumento significativo das células em estágio de morte das células tratadas em relação ao controle, com características predominantemente apoptóticas. Posteriormente, foi avaliada a capacidade dos extratos selecionados de inibir a migração das células tumorais, pelo ensaio de Wound Healing. Foi observado que nenhuma das frações testadas foi capaz de inibir, nem de reduzir a migração das linhagens U251 e GAMG. Em concordância, foram observadas projeções de superfície, mesmo quando as células foram tratadas. O efeito das frações de M. radula sobre a atividade da Metaloproteinase de Matriz 9 (MMP-9) foi avaliado por zimografia. Foi observado que as frações 23-B4, 23-B5 e 23-C6 foram capazes de reduzir a atividade da enzima proteolítica. Adicionalmente, as frações com potencial de reduzir a atividade da protease foram avaliadas sobre a adesão da linhagem U251. Foi possível perceber que as amostras modularam o complexo envolvido com a manutenção das junções, uma vez que aumentaram a adesividade celular. Além disso, a afinidade da Anexina V pela fosfatidilserina foi testada qualitativamente, após tratamento das células (U251) com as frações 23-B4, 23-B5 e 23-C6. Observou-se que o número de células marcadas com a fluorescência foi analiticamente maior quando submetidas ao tratamento. Em adição, pôde-se verificar maior concentração dos marcadores na região celular periférica. Pela especificidade do teste, os dados podem indicar a indução de morte celular por apoptose. Baseado nisso, tais resultados foram utilizados como critério de seleção das proteínas, cuja a expressão foi avaliada por Western Blotting. Tendo isso em vista, o efeito das amostras sobre a modulação de enzimas apoptóticas foi verfificado sobre a U251. A fração 23-B4 não apresentou capacidade de modular significarivamente nenhuma das proteínas avaliadas. Já as frações 23-B5 e 23-C6 foram capazes de regular a expressão de proteínas envolvidas com a indução da morte celular programada, independente da ativação das Caspases. Apresentaram o mesmo perfil de atuação, e mostraram ativar fatores apopotóticos intrínsecos. Finalmente, a fração que apresentou maior seletividade tumoral (23-B5) foi avaliada, in vivo. A fração foi capaz de reduzir expressivamente o perímetro tumoral e potencial sobre a modulação negativa de fatores angiogênicos. As amostras foram capazes de modular parâmetros envolvidos na progressão do tumor, sendo considerados promissores candidatos antitumorais.


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  • Glioblastoma Multiforme (GBM) is the most aggressive type of neoplasm of the central nervous system. Although rare, it has a poor prognosis and a low survival rate. Statistics show an increase in the incidence of cancer with a linear tendency to increase the mortality rate. In addition, GBM does not. Although some treatments already await this type of tumor, they are known to be highly invasive. In this context, an alternative is sought to the range of secondary compounds that natural products can offer, with biological and therapeutic properties. Therefore, the objective of the work was to evaluate an antitumor capacity of derivatives of the species Macairea radula on human glioma cell lines. First, as a positive control, the cytotoxicity of Temozolamide (TMZ) on tumor lines (U251 and GAMG) and on the normal astrocyte line - NHA, was evaluated for 24 and 72 hours. The Tumor Selectivity Index (SI) of the chemotherapeutic agent was calculated. It was observed that TMZ did not show selectivity for any of the studied tumor lines. At the same time, the hexane and chloroform partitions of M. radula were selected through previous screening for fractionation by column chromatography. Six fractions derived from B and 8 derived from C partition were obtained. The cytotoxicity of 12 of the fractions was evaluated, concomitantly with partitions B and C on lines U251, GAMG and NHA (24 and 72 hours). The IS of each of the corresponding extracts was calculated. Those fractions that presented higher IS with 72 hours IC50 were selected - 23-B3, 23-B4, 23-B5 and 23-C6. Characteristic morphological changes, in response to the cytotoxicity of the fractions, were observed. In corroboration, the characterization of cell death was performed through the fluorescence assay. It was observed that there was an increase in the cells in the death stage of the treated cells, with predominantly apoptotic characteristics. Subsequently, the ability of the selected extracts to inhibit the migration of tumor cells was evaluated by the Wound Healing. It was observed that none of the tested fractions was able to inhibit or to reduce the migration of the U251 and GAMG. Accordingly, surface projections were observed, even when the cells were treated. The effect of the fractions on Matrix Metalloproteinase 9 (MMP-9) activity was performed by zimografy. It was observed that fractions 23-B4, 23-B5 and 23-C6 were able to reduce the activity of the proteolytic enzyme. Additionally, these fractions were evaluated on the adhesion of the U251 line. It was possible to notice that the samples modulated the complex involved with the maintenance of the junctions, since they increased cell adhesiveness. In addition, the affinity of Annexin V for phosphatidylserine was tested qualitatively, after treatment of cells (U251) with fractions 23-B4, 23-B5 and 23-C6. It was observed that the number of cells marked with fluorescence was analytically higher when subjected to treatment. In addition, it was possible to verify a higher concentration of markers in the peripheral cell region. Due to the specificity of the test, the data may indicate the induction of cell death by apoptosis. Based on that, these results were used as a protein selection criterion, whose expression was evaluated by Western Blotting. In view of this, the effect of the samples on the modulation of apoptotic enzymes was verified on U251. The 23-B4 fraction did not show the ability to modulate any of the evaluated proteins. Fractions 23-B5 and 23-C6 were able to regulate the expression of proteins involved in the induction of programmed cell death, regardless of Caspase activation, and were shown to activate intrinsic apopototic factors. Finally, the fraction with the highest tumor selectivity (23-B5) was evaluated, in vivo. The fraction was able to significantly reduce the tumor perimeter and it demonstrated potential for the negative modulation of angiogenic factors. The samples were able to modulate parameters involved in tumor progression, being considered promising antitumor candidates.

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