Banca de QUALIFICAÇÃO: PRISCILA AMARAL DINIZ

Uma banca de QUALIFICAÇÃO de MESTRADO foi cadastrada pelo programa.
DISCENTE : PRISCILA AMARAL DINIZ
DATA : 23/02/2022
HORA: 09:00
LOCAL: meet.google.com/kbo-ismh-fnc
TÍTULO:

DESENVOLVIMENTO DE UM SISTEMA E EXPRESSÃO HETERÓLOGA EM Penicillium camemberti

PALAVRAS-CHAVES:

biotecnologia, Penicillium camemberti, modificações genéticas, sistema de expressão, fungos filamentosos

PÁGINAS: 31
RESUMO:

A manipulação genética de organismos tem se mostrado um dos avanços mais
promissores da biotecnologia, sendo possível destacar o desenvolvimento da obtenção de
produtos de interesse econômico e industrial. Com a finalidade de produção de proteínas de
interesse, podem ser desenvolvidos sistemas de expressão heteróloga, que são sistemas de
produção de proteínas gerados através da modificação genética de um organismo. Embora os
fungos filamentosos sejam microrganismos que detêm um robusto sistema de secreção de
proteínas, não há um sistema de expressão heteróloga disponíveis comercialmente neste
organismo, além de haver uma escassez de trabalhos científicos utilizando tais sistemas. Neste
trabalho foi iniciado o desenvolvido de um sistema de expressão heteróloga em Penicillium
camemberti. Esse é um fungo filamentoso que possui bioprocessos com status GRAS para
produção de lipase, realiza modificações pós- traducionais como glicosilação, fosforilação e
pontes dissulfeto, faz secreção de grandes quantidades de enzimas no meio extracelular, além
de ser cultivado em meios de baixo custo e possuir potencial para melhoramento genético.
Para o estudo do sistema de expressão, selecionou-se uma galactosidase, a alfa-amilase (α-
amy), oriunda do próprio Penicillium camemberti, assim como os componentes de uma ORF,
fase de leitura aberta, como as sequencias promotora e terminadora. Para tal, foi utilizada a
técnica de reação em cadeia da polimerase de fusão (PCR de fusão), que permite obter várias
ORFs com diferentes promotores e terminadores, possibilitando otimizar as construções para
produção de proteínas de interesse industrial.  Com a finalidade de se testar o nível de
expressão da ORF com diferentes construções, escolheu-se promotores constitutivos e
induzíveis já utilizados em vetores de expressão em outros microrganismos como das
proteínas citrato sintase, da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e da 3-fosfoglicerato
quinase. O terminador utilizado foi da proteína de biossíntese de triptofano. Com as
amplificações das sequências dos promotores, do gene alvo e terminador, otimizou-se a PCR
de fusão a 59°C devido ao anelamento dos megaprimers utilizados na técnica, que também
permite a fusão dos fragmentos em uma ORF com o gene alvo. Paralelamente, realizou-se
análises in silico da enzima alfa-amilase para obter dados como características físico -
químicas, estruturais, localização celular e similaridade. Alguns dados obtidos foram de
número de aminoácidos, peso molecular, ponto isoelétrico teórico, número de resíduos
carregados negativamente, número de resíduos carregados positivamente e coeficiente de
hidropaticidade. Os estudos preliminares indicaram que a alfa-amilase de P. camemberti é
uma enzima extracelular e que é facilmente secretada do meio intracelular, o que já indica que
está é uma enzima cujas características tendem a ser promissoras a produção em larga escala
para diversos fins como na aplicação da indústria têxtil e alimentícia.

MEMBROS DA BANCA:
Presidente - 1757978 - DANIEL BONOTO GONCALVES
Interno - 1367304 - ALEXSANDRO SOBREIRA GALDINO
Externo à Instituição - LEONARDO AUGUSTO DE ALMEIDA - UNIFAL-MG