DESENVOLVIMENTO E APLICAÇÃO TECNOLÓGICA DE NOVOS MARCADORES MOLECULARES MULTIESPECÍFICOS DE DNA PARA PEIXES DE PIRACEMA DE IMPORTÂNCIA SOCIOAMBIENTAL
Biodiversidade, conservação, microssatélites, NGS, piracema, piscicultura
As espécies de peixes migratórios Salminus brasiliensis, Brycon orbignyanus, Prochilodus lineatus e Megaleporinus obtusidens possuem grande importância ecológica, econômica e cultural na América do Sul. Estes organismos encontram-se ameaçados por vários fatores como barragens hidrelétricas, introdução de espécies invasoras, poluição e degradação do habitat. Os marcadores moleculares microssatélites são importantes ferramentas biotecnológicas, particularmente para o levantamento da variação genética de populações devido à codominância, hipervariabilidade e distribuição no genoma. Embora esses marcadores sejam normalmente de caráter espécie-específicos, o que exige o seu desenvolvimento de novo para organismos de interesse, uma forma tradicional de contornar essa limitação é sua transferência para espécies próximas (amplificação cruzada ou heteróloga). No entanto, isso apresenta alguns entraves, como o baixo aproveitamento de loci testados, além da possível ocorrência de alelos nulos. A facilitação recente de obtenção de dados genômicos permite a comparação direta de regiões de DNA conservadas entre espécies. Assim, este trabalho visa o desenvolvimento biotecnológico de marcadores microssatélites multiespecíficos, capazes de serem aplicados simultaneamente em uma ampla gama filogenética de peixes migratórios, como S. brasiliensis, B. orbignyanus, P. lineatus e M. obtusidens, abrangendo pelo menos três famílias taxonômicas distintas, assim como o desenvolvimento de sistemas multiplex com estes marcadores de DNA. Foram selecionados 40 loci candidatos conservados e compartilhados entre genomas, a partir de um painel mais amplo de 977 microssatélites caracterizados por sequenciamento de nova geração. Dentre estes, 16 marcadores (Poli09, Poli11, Poli12, Poli18, Poli19, Poli20, Poli21, Poli23, Poli25, Poli26, Poli28, Poli31, Poli32, Poli34, Poli35 e Poli40) apresentam amplificação em todas as espécies-alvo; 14 amplificam em pelo menos duas espécies-alvo, enquanto 10 microssatélites não apresentam amplificação. A avaliação da variabilidade genética é realizada com uma amostra populacional de 20 indivíduos de cada espécie-alvo, provenientes da bacia do rio Grande, MG. A análise populacional evidencia até 17 alelos em S. brasiliensis, até 16 alelos em B. orbignyanus, até 13 alelos em P. lineatus e até 12 alelos em M. obtusidens. Os loci que estão em conformidade com o Equilíbrio de Hardy-Weinberg são: Poli18, Poli20 e Poli26 em S. brasiliensis; Poli20, Poli25, Poli26 e o Poli31 em B. orbignyanus; Poli18, Poli25 e Poli35 em P. lineatus, e em M. obtusidens Poli11, Poli20, Poli25, Poli26, Poli28 e o Poli40. No locus Poli11, a amostra de B. orbignyanus exibe caráter monomórfico o que pode evidenciar a baixa variabilidade genética em estoques dessa espécie. Além do conjunto de 16 marcadores microssatélites multiespecíficos apresentado, três sistemas multiplex totalizando 12 marcadores multiespecíficos é desenvolvido, representando uma redução de 75% no número de reações tipo PCR relativo à amplificação individualizada de cada marcador. A utilização desses marcadores multiespecíficos e dos sistemas multiplex oferecem vantagens como a redução de custos e aumento da celeridade nas análises genéticas, o que facilita o manejo de estoques naturais e cultivados dessas espécies, para finalidades comerciais ou de mitigação de impactos ambientais, fornecendo subsídios para o manejo da pesca e desenvolvimento da aquicultura no país.